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　　非洲豬瘟病毒熒光等溫擴增檢測試劑盒Neeg Asmeskas swine fever kab mob fluorescence isothermal amplification nrhiav kom tau cov khoom siv【FT-ZWSJ2】督促嚴格落實產(chǎn)地檢疫、屠宰環(huán)節(jié)*獸醫(yī)派駐和非洲豬瘟自檢的相關制度，加大調運環(huán)節(jié)、無害化處理等環(huán)節(jié)的監(jiān)管力度，強化閉環(huán)管理，阻斷疫情的傳播渠道。

　　非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書

　　【獸藥名稱】

　　通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒

　　漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

　　英文名稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

　　商品名稱：無

　　【主要成分與含量】試劑盒中含有如下組分:

　　【用法與判定】

　　1 用法

　　1.1待檢樣品釆集、保存及運輸

　　1.1.1樣品釆集

　　(1) 活豬樣品 無菌采集抗凝血或血清5mL

　　(2) 病死豬剖檢樣品或屠宰場剖檢樣品 無菌采集死豬的牌、肺、腎、扁桃體、淋巴結、肌肉等組織樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

　　(3) 病豬污染的周邊環(huán)境 采集與病豬相關場所的糞便、飼料、污水樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

　　1.1.2樣品保存 采集的樣品在2?8°C保存應不超過24小時，-70°C條件下保存，避免反復凍 融。

　　1.1.3樣品運輸泡沫箱加冰袋后密封進行運輸。包裝和運輸應符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動  物病原微生物菌(毒)種或者樣品運輸包裝規(guī)范》和交通運輸部門關于危險品運輸管理的有關規(guī)定。

　　1.2樣品處理

　　1.2.1血液樣品處理 抗凝血樣品置于離心管中，8000 r/min離心2分鐘取上層血漿，編號待 檢。非抗凝血樣品置于離心管中，待凝固后，8000  r/min離心2分鐘取200μL上層血清，編號待檢。

　　1.2.2組織樣品處理取適量脾臟、肝臟、淋巴結、扁桃體、肌肉等組織，置于研磨器或研磨管中研磨，再加適量生理鹽水混勻，制成約10%的組織勻漿，8000  r/min離心2分鐘，取200μL上 清于RNase/DNase-free無菌離心管中，編號備用。

　　1.2.3環(huán)境樣品處理

　　1.2.3.1糞便、飼料樣品處理方法取適量的糞便、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中研磨混勻，制成約10%的勻漿液.8000  r/min離心2分鐘，取200μL上清于RNase/DNase-free無菌離心 管中，編號備用。

　　1.2.3.2污水樣品處理方法 直接取200μL污水進行核酸提取。

　　1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法進行DNA核酸提取。

　　1.4熒光PCR反應：

　　1.4.1從試劑盒中取出熒光PCR反應液、酶混合液，室溫融化后，2000 r/min離心5秒。設被  檢樣品、陽性對照和陰性對照總和為n,則反應體系配制如下：

　　試劑 體系

　　PCR 反應液 17× (n+1) μL

　　酶混合液 3× (n+1) μL

　　1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20μL/  管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應管。

　　1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應管中分別加入陰性對照、陽性對照各5μL、處理好的待測核酸各5μL,終體積25μL/管，蓋好熒光PCR反應管蓋，混勻后瞬時離心，轉移到熒光PCR儀器  上。

　　144將PCR反應管放置在熒光PCR儀樣品槽中，在熒光PCR儀上運行以下程序：

　　熒光通道選擇FAM,在PCR擴增階段每個循環(huán)的55℃時采集熒光信號。設置擴增體系為25μL, 同時要選擇passive  reference和quencher為none的模式。(注：若熒光PCR儀(如AB17500)按說明  書中的反應程序設置后因持溫時間短無法運行，可將預擴增和PCR擴增條件變更為95C： 5秒 55°C： 30 秒)

　　2結果判定

　　2.1試驗有效性判定

　　陽性對照有典型擴增曲線且Ct值≤30.且陰性對照無Cl值或無擴增曲線，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。則判試驗結果有效。否則，此次試驗視為無效。

　　2.2樣品判定

　　2.2.1陽性：樣本檢測結果Ct值≤35且有明顯指數(shù)增長期，判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。

　　2.2.2可疑：樣本檢測結果Ct值在35?38范圍內。此時應對樣本進行重復檢測，如果重復實驗  結果Ct值仍在35?38范圍內，有明顯指數(shù)增長期.則判定為陽性，否則為陰性。

　　2.2.3陰性：樣本檢測結果Ct值>38或無Ct值，判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。

　　【注意事項】(1)實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書，嚴格按照操作步驟執(zhí)行，在操作過 程中對時間、試劑體積等精確控制可以獲得結果。

　　(2) 實驗室應嚴格按照有關規(guī)定分區(qū)管理，依照配液區(qū)-模板提取區(qū)-擴增區(qū)-分析區(qū)順序  進行基因檢測。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應有嚴格要求。

　　(3) 核酸提取有關耗村確保潔凈、無DNase/RNase,提取過程盡量低溫、快速，完成后進入 下一步實驗或凍保。

　　(4) 對于頂部采光儀器要帶新的一次性PE手套對熒光PCR管封蓋，對于底部采光儀

　　器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR管底，檢測過程中使用不帶熒光物質一次性乳膠手套。

　　(5) 凍存試劑使用前應于室溫下*融化，瞬時離心使液體*沉于管底。避免反復凍融， 以免影響試劑性能。

　　(6) 樣品、陽性對照等在使用后及時封蓋，.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性。

　　(7) 擴增產(chǎn)物禁止開蓋，實驗產(chǎn)生的廢棄物應及時收集，遠離PCR實驗室進行無害化處理。

　　【規(guī)格】50頭份/盒